过滤后避光保存

注：Acr/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择（见下表）

1. 边摇晃溶液变加入TEMED 和10%过硫酸铵。

2. 再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置 30-60 分钟 等待胶凝固。 3. 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的 1×TBE电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。 

4. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的 Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。

5. 在上样前，预电泳 20-30 分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可 以使凝胶的温度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 变性状态。 

6. 将 miRNA 样品与等体积的 miRNAon 混合，70℃保温 2-3 分钟后迅速放 置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。miRNA Marker 需要每个 上样孔用 5uL，一块胶最好在两侧各用一个孔上样 miRNA Marker。 

7. 关电泳仪后开始上样。 

8. 重开电泳仪，对 13 cm×15 cm 的胶，以 20-30mA 的电流电泳，直到红 色染料移动到凝胶边缘为止；对 36 cm×45 cm 的胶，则以 50-60mA 的 电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。 

9. 染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（固定、漂洗、显影和定影等步骤）、EB（每 100 mL 1×TBE 中加 20 uL 10mg/mL 的 EB 溶液）。UV 下观察并拍照。 

10. miRNA 回收：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置，切胶后进行胶回收处理。 

11. Northern 杂交：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置，切胶后电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。